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豬雄烯酮(ADT)ELISA試劑盒-競爭法檢測原理

發(fā)布時(shí)間:2024-09-02   點(diǎn)擊次數:379次

豬雄烯酮(ADT)ELISA試劑盒-競爭法檢測原理

本試劑盒采用競爭法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。在預包被抗豬雄烯酮(ADT)抗體(固相抗體)的微孔酶標板中,加入豬雄烯酮(ADT)校準品和待測樣本,再加入HRP標記的豬雄烯酮(ADT)抗原(酶標抗原),經(jīng)過(guò)溫育與充分洗滌,去除未結合的組分,在微孔板固相表面形成固相抗體-酶標抗原的免疫復合物。加底物A和B,底物在HRP催化下,產(chǎn)生藍色產(chǎn)物,在終止液(2M 硫酸)作用下,最終轉化為黃色,在酶標儀450nm波長(cháng)上測定吸光度(OD值),吸光度(OD值)與待測樣品中豬雄烯酮(ADT)的濃度負相關(guān)。擬合校準品曲線(xiàn),可以計算出樣本中豬雄烯酮(ADT)的濃度。

試劑盒限制性

1、 僅供科研使用,不得用于臨床診斷。

2、 在試劑盒標示的有效期內使用,過(guò)期產(chǎn)品不得使用。

3、 跟其他廠(chǎng)家的試劑盒或者組分不能混用。

4、 使用試劑盒配套的樣品稀釋液。

5、 如果樣本值高于最高標準品濃度值,請將樣本適當稀釋后,再重新測定。

6、 待測樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會(huì )干擾檢測結果,檢測前,請排出該因素。

7、 通過(guò)其他方法得到的檢測結果,與本試劑盒測定結果不具有直接的可比性。

技術(shù)提示

1、 混合蛋白溶液時(shí),避免起泡。

2、 加校準品與樣本時(shí),每個(gè)校準品濃度和樣本都要更換移液槍頭,公共組分應該懸臂加樣,避免交叉污染。

3、 合適的溫育時(shí)間,和充分的洗滌步驟,是保證實(shí)驗結果準確性的必要條件。

4、 使用自動(dòng)洗板機時(shí),加入一個(gè)30秒浸泡的步驟,可以提高檢測精度。

5、 底物溶液為無(wú)色液體,保存過(guò)程中變?yōu)樗{色,代表底物溶液已經(jīng)失效,不得使用。

6、 終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致,加入終止液后,藍色底物產(chǎn)物,會(huì )瞬間變?yōu)辄S色。

7、 實(shí)驗中,用剩的板條,應立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。

8、 所有液體組分,使用前充分搖勻,嚴格按照說(shuō)明書(shū)標明的時(shí)間、加樣量及加樣順序進(jìn)行溫育操作。

試劑盒組分與保存

未開(kāi)封的試劑盒保存在2-8度,不得使用過(guò)期試劑盒。

組分

數量

主要成分

開(kāi)封后儲存

校準品

0.3ml/管

--

2-8℃14天

包被微孔板

96T/48T

預包被固相抗體

2-8℃14天

HRP標記抗原

10mL

HRP標記的檢測抗原

2-8℃180天

底物液A

6mL

0.01%過(guò)氧化氫

2-8℃180天

底物液B

6mL

0.1%TMB

2-8℃180天

終止液

6mL

2mol/L稀硫酸

2-8℃180天

樣本稀釋液

6mL

PBS

2-8℃180天

20×濃縮洗滌液

25mL

0.05%Tween20

2-8℃180天

說(shuō)明書(shū)

1份

--

--

自封袋

1個(gè)

--

--

不干膠

2片

--

--

標準品濃度依次為:12、6、3、1.5、0.75、0 nmol/L.

操作程序

所有試劑和組分都先恢復到室溫,標準品、質(zhì)控品和樣品,建議做復孔。

1、 按前面說(shuō)明書(shū)描述的方法,配制好試劑盒各種組分的工作液。

2、 從鋁箔袋中取出所需板條,剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。

設置標準品孔、空白孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL,空白孔不加,樣本孔加待測樣本50μL。

3、除空白孔外,標準品孔和樣本孔,加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標記的檢測抗原100μL。

1、 用封板膜蓋住反應板,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

2、 揭開(kāi)封板膜,棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿(mǎn)洗滌液,靜置20S,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復5次。若使用自動(dòng)洗板機,請按洗板機操作程序進(jìn)行洗板,添加浸泡30s的程序,可以提高檢測的精度。洗板結束,加底物前,要在干凈不掉屑的紙上,充分拍干反應板。

3、 將底物A和B按1:1體積充分混合,所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜蓋住反應板,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min。

4、 所有孔加入終止液50μL,在酶標儀上讀取各孔吸光度(OD值)。

結果計算

1、 以標準品濃度做為橫坐標,對應的吸光度(OD值)作為縱坐標,利用計算機軟件,采用四參數Logistic曲線(xiàn)擬合(4-pl),創(chuàng )建標準曲線(xiàn)方程,通過(guò)樣本的吸光度(OD值),利用方程計算樣品的濃度值。

2、 如果樣品被稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)上述方法測的濃度值,要乘以稀釋倍數,才是樣品的最終濃度。

 


 

試劑盒性能指標

1、物理性能

試劑盒的各液體組分應澄清透明、無(wú)沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應真空包裝,無(wú)破損漏氣。

2、劑量反應曲線(xiàn)線(xiàn)性

校準品劑量反應曲線(xiàn)相關(guān)系數r值,大于等于0.9900。

3、精密度

批內精密度:三組已知的高、中、低濃度樣品,進(jìn)行二十次在同一個(gè)板塊內精度評估。批內變異系數CV%小于10%。

批間精密度:三組已知的高、中、低濃度樣品,進(jìn)行二十次在不同板塊內精度評估。批間變異系數CV%小于15%。

4、靈敏度

檢出劑量小于0.1 nmol/L。

5、回收率

三組已知的高、中、低濃度樣品,進(jìn)行五次在同一個(gè)板塊內回收率評估,回收率在85%-115%之間。

6、特異性

本試劑盒識別天然和重組豬雄烯酮(ADT),與結構類(lèi)似物無(wú)交叉。

7、穩定性

2℃-8℃保存,有效期6個(gè)月。

5、 檢測范圍

0.375 nmol/L - 12 nmol/L